Механизм действия ферментов

Механизм действия ферментов может быть рассмотрен с двух позиций: с точки зрения изменения энергетики химических реакций и с точки зрения событий в активном центре.

А. Энергетические изменения при химических реакциях

Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум основным законам термодинамики: закону сохранения энергии и закону энтропии. Согласно этим законам, общая энергия химической системы и её окружения остаётся постоянной, при этом химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии). Для понимания энергетики химической реакции недостаточно знать энергетический баланс входящих и выходящих из реакции реагентов, необходимо учитывать изменения энергии в процессе данной химической реакции и роль ферментов в динамике этого процесса. Рассмотрим реакцию разложения угольной кислоты:

Н 2 СО 3 > Н 2 0 + С0 2 .

Угольная кислота слабая; реакция её разложения пойдёт цри обычных условиях, если молекулы угольной кислоты имеют энергию, превышающую определённый уровень, называемый энергией активации Е а (рис. 2-10).

Энергией активации называют дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию.

При достижении этого энергетического барьера в молекуле происходят изменения, вызывающие перераспределение химических связей и образование новых соединений. Говорят, что молекулы, обладающие Е а, находятся в переходном состоянии. Разницу энергий между исходным реагентом Н 2 СО 3 и конечными соединениями Н 2 О и СО 2 называют изменением свободной

Рис. 2-10. Изменение свободной энергии при разложении угольной кислоты.

Энергии реакции DG. Молекулы Н 2 О и СО 2 - более стабильные вещества, чем Н 2 СО 3 , т.е. обладают меньшей энергией и при обычных условиях практически не реагируют. Выделившаяся энергия в результате этой реакции рассеивается в виде тепла в окружающую среду.

Чем больше молекул обладает энергией, превышающей уровень Е а, тем выше скорость химической реакции. Повысить скорость химической реакции можно нагреванием. При этом увеличивается энергия реагирующих молекул. Однако для живых организмов высокие температуры губительны, поэтому в клетке для ускорения химических реакций используются ферменты. Ферменты обеспечивают высокую скорость реакций при оптимальных условиях, существующих в клетке, путём понижения уровня Е а. Таким образом, ферменты снижают высоту энергетического барьера, в результате возрастает количество реакционно-способных молекул, следовательно, увеличивается скорость реакции.

В механизме ферментативного катализа решающее значение имеет образование нестойких промежуточных соединений - фермент-субстратный комплекс ES, подвергающийся превращению в нестабильный переходный комплекс ЕР, который почти мгновенно распадается на свободный фермент и продукт реакции.

Таким образом, биологические катализаторы (ферменты) не изменяют свободную энергию

субстратов и продуктов и поэтому не меняют равновесие реакции (рис. 2-11).

Фермент, выполняя функцию катализатора химической реакции, подчиняется общим законам катализа и обладает всеми свойствами, характерными для небиологических катализаторов, однако имеет и отличительные свойства, связанные с особенностями строения ферментов.

Сходство ферментов с небиологическими катализаторами заключается в том, что:

• · ферменты катализируют энергетически возможные реакции;
• · энергия химической системы остаётся постоянной;
• · в ходе катализа направление реакции не изменяется;
• · ферменты не расходуются в процессе реакции.

Отличия ферментов от небиологических катализаторов заключаются в том, что:

• · скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми катализаторами;
• · ферменты обладают высокой специфичностью;
• · ферментативная реакция проходит в клетке, т.е. при температуре 37 °С, постоянном атмосферном давлении и физиологическом значении рН;
• · скорость ферментативной реакции может регулироваться.

1. Формирование фермент-субстратного комплекса

Тот факт, что ферменты обладают высокой специфичностью, позволил в 1890 г. выдвинуть гипотезу, согласно которой активный центр фермента комплементарен субстрату, т.е. соответствует ему как "ключ замку". После взаимодействия субстрата ("ключ") с активным центром ("замок") происходят химические превращения субстрата в продукт. Активный центр при этом рассматривался как стабильная, жёстко детерминированная структура.

В 1959 г. был предложен другой вариант гипотезы "ключ-замок", объясняющий события в активном центре фермента. По этой гипотезе активный центр является гибкой структурой

Рис. 2-11. Изменение свободной энергии в ходе химической реакции, некатализируемой и катализируемой ферментами.

Фермент понижает энергию активации Е а, т.е. снижает высоту энергетического барьера, в результате возрастает доля реакционно-способных молекул, следовательно, увеличивается скорость реакции по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса, благоприятного для химических модификаций субстрата. При этом молекула субстрата также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции. Эта "гипотеза индуцированного соответствия" впоследствии получила экспериментальное подтверждение.

2. Последовательность событий в ходе ферментативного катализа

Процесс ферментативного катализа условно можно разделить на следующие этапы (рис. 2-12). субстратный катализ химический реакция

Первый, второй и четвёртый этапы катализа непродолжительны и зависят от концентрации субстрата (для первого этапа) и констант связывания лигандов в активном центре фермента (для первого и третьего этапов). Изменения энергетики химической реакции на этих стадиях незначительны.

Третий этап наиболее медленный; длительность его зависит от энергии активации химической реакции. На этой стадии происходят разрыв связей в молекуле субстрата, образование новых связей и формирование молекулы продукта.

3. Роль активного центра в ферментативном катализе

В результате исследований было показано, что молекула фермента, как правило, во много раз больше молекулы субстрата, подвергающегося химическому превращению этим ферментом. В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть молекулы фермента, обычно от 5 до 10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Роль остальных аминокислотных остатков состоит в обеспечении правильной конформации молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции.

Активный центр на всех этапах ферментативного катализа нельзя рассматривать как пассивный участок для связывания субстрата. Это комплексная молекулярная "машина", использующая разнообразные химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт.

В активном центре фермента субстраты располагаются таким образом, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Это свойство активного центра называют эффектом сближения и ориентации реагентов. Такое упорядоченное расположение субстратов вызывает уменьшение энтропии и, как следствие, снижение энергии активации (Е а), что определяет каталитическую эффективность ферментов.

Активный центр фермента также способствует дестабилизации межатомных связей в молекуле субстрата, что облегчает протекание химической реакции и образование продуктов. Это свойство активного центра называют эффектом деформации субстрата (рис. 2-12).

Рис. 2-12. Этапы ферментативного катализа.

I - этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента; II - образование фермент-субстратного комплекса (ES) в результате индуцированного соответствия; III - деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР); IV- распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и освобождением фермента.

В. Молекулярные механизмы ферментативного катализа

Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функциональных групп активного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт. Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа: кислотно-основной катализ и ковалентный катализ.

1. Кислотно-основной катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ - часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.

К аминокислотам, участвующим в кислотно-основном катализе, в первую очередь относят Цис, Тир, Сер, Лиз, Глу, Асп и Гис. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме - кислоты (доноры протона), в депротонированной - основания (акцепторы протона). Благодаря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникальными биологическими катализаторами, в отличие от небиологических катализаторов, способных проявлять либо кислотные, либо основные свойства.

Примером кислотно-основного катализа, в которм кофакторами являются ионы Zn 2+ , а в качестве кофермента используется молекула NAD + , можно привести фермент алкогольдегидрогеназу печени, катализирующую реакцию окисления спирта (рис. 2-13):

С 2 Н 5 ОН + NAD + > СН 3 -СОН + NADH + H

2. Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нук-леофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента.

Действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин и тромбин, - пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента. Термин "сериновые протеазы" связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра всех этих ферментов и участвует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере хи-мотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке (см. раздел 9). Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими

Рис. 2-13. Механизм кислотно-основного катализа на примере алкогольдегидрогеназы печени.

I - молекула этилового спирта имеет центр связывания, обеспечивающий гидрофобное взаимодействие активного центра и метильной группы спирта; II - положительно заряженный атом цинка способствует отщеплению протона от спиртовой группы этанола с образованием отрицательно заряженного атома кислорода. Отрицательный заряд перераспределяется между атомом кислорода и соседним атомом водорода, который затем в виде гидритиона переносится на четвёртый углеродный атом никотинамида кофермента NAD+; III - в результате формируется восстановленная форма NADH и уксусный альдегид.

Гидрофобными радикалами (Фен, Тир, Три), что указывает на участие гидрофобных сил в формировании фермент-субстратного комплекса. Механизм ковалентного катализа химотрипсина рассмотрен на рис. 2-14.

Радикалы Асп 102 , Гис 57 и Сер 195 участвуют непосредственно в акте катализа. Вследствие нуклеофильной атаки пептидной связи субстрата происходит разрыв этой связи с образованием ковалентно-модифицированного серина - ацил-химотрипсина. Другой пептидный фрагмент высвобождается в результате разрыва водородной связи между пептидным фрагментом и Гис 57 активного центра химотрипсина. Заключительный этап гидролиза пептидной связи белков - деацилирование химотрипсина в присутствии молекулы воды с высвобождением второго фрагмента гидролизуемого белка и исходной формы фермента.

фермент биологический катализ трансаминирование

Раскрытие с помощью рентгеноструктурного анализа пространственного строения ряда ферментов явилось надежной основой для построения рациональных схем механизма их действия.

Установление механизма действия ферментов имеет ключевое значение для раскрытия структурно-функциональных взаимосвязей во множестве биологически активных систем.

Лизоцим обнаружен в различных тканях животных и растений, он находится, в частности, в слезной жидкости и яичном белке. Лизоцим функционирует как антибактериальный агент, катализируя гидролиз клеточных стенок ряда бактерий. Этот полисахарид образован чередующимися остатками N-ацетилмурановой кислоты (NAM), соединенными в-1,4-гликозидной связью (полисахаридные цепи сшиты короткими пептидными фрагментами).

Бактериальный полисахарид является весьма сложным нерастворимым соединением, в связи с чем в качестве субстратов лизоцима часто используют хорошо гидролизуемые олигосахариды, образованные остатками NAG.

Лизоцим белка куриных яиц образован одной полипептидной цепью, содержащей 129 аминокислотных остатков; его молекулярная масса составляет 14 600. Высокая стабильность фермента обеспечивается наличием четырех дисульфидных мостиков.

Информация об активном центре и типе каталитического процесса была получена Д. Филипсом в 1965г. на основе рентгеноструктурных исследований лизоцима и его комплексов с ингибиторами. Молекула лизоцима имеет форму эллипсоида с осями 4,5*3*3 нм; между двумя половинами молекулы находится «щель», в которой происходит связывание олигосахаридов. Стенки щели образованы в основном боковыми цепями неполярных аминокислот, обеспечивающими связывание неполярных молекул субстрата, и включают также боковые цепи полярных аминокислот, которые способны образовывать водородные связи с ациламинными и гидроксильными группами субстрата. Размер щели позволяет разместиться молекуле олигосахарида, содержащей 6 остатков моносахаридов. Методом рентгеноструктурного анализа установить характер связывания субстрата, например гексасахарида NAG 6 , не удается. В то же время комплексы фермента с ингибитором трисахаридом NAG 3 стабильны и хорошо изучены. NAG 3 связывается в щели на поверхности фермента, образуя водородные связи и ван-дер-ваальсовы контакты; при этом он заполняет только половину щели, в которой могут связаться еще три моносахаридных остатка. Невосстанавливающий конец (сахар А) оказывается у начала щели, а восстанавливающий конец (сахар С) - в центральной ее части; остатки сахаров А, В и С имеют конформацию кресла. Построение модели фермент-субстратного комплекса было основано на предположении о том, что при связывании субстрата NAG 6 реализуются те же взаимодействия, что и при связывании NAG 3 . На модели фермента внутри щели были размещены три остатка сахара (обозначаемые как остатки D, E и F); каждый последующий сахар присоединялся таким образом, чтобы его конформация была такой же (насколько это возможно), как и у первых трех сахаров. В составе модельного комплекса все остатки сахаров реализуют эффективные нековалентные взаимодействия с боковыми и пептидными группами аминокислотных остатков, образующих щель.

При идентефикации каталитических групп естественно было сосредоточить внимание на тех из них, которые в фермент-субстратном комплексе находятся около расщепляемой гликозидной связи и могут служить донорами или акцепторами протонов. Оказалось, что по одну сторону от расщепляемой связи, на расстоянии? 0,3 нм (от кислорода гликозидной связи), находится карбоксильная группа Glu-35, а по другую (на таком же расстоянии) карбоксильная группа Asp-52, окружение их сильно различается. Glu-35 окружена гидрофобными остатками; можно предполагать, что в оптимуме рН фермента эта группа находится в неионизированном состоянии. Окружение Asp-52 выражено полярное; ее карбоксильная группа участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей и функционирует, вероятно, в ионизированном состоянии.

Предложена следующая схема каталитического процесса при гидролизе олигосахарида. Неионизированная карбоксильная группа Glu-35 выступает в качестве донора протона, поставляя его гликозидному атому кислорода между атомом С (1) сахара D и атомом С(4) сахара Е (стадия общего кислотного катализа); это приводит к разрыву гликозидной связи. В результате остаток сахара D переходит в состояние карбкатиона с положительно заряженным атомом углерода С (1) и принимает конформацию полукресла. Отрицательный заряд карбоксилатной группы Asp-52 стабилизирует карбкатион. Остаток NAG 2 (сахара E+F) диффундирует из области активного центра. Затем в реакцию вступает молекула воды; ее протон переходит к Glu-35, а ОН - -группа к атому С (1) остатка D (стадия основного катализа). Остаток NAG 4 (сахара А+В+С+D) уходит из области активного центра, и фермент возвращается в исходное состояние.

Рибонуклеаза (РНКаза) поджелудочной железы быка гидролизует межнуклеотидные связи в РНК около пиримилиновых звеньев, которые при этом остаются этерифицированы по 3"-положению. Фермент наряду с другими нуклеазами широко используется при анализе структуры РНК.

РНКаза образована одной полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных остатка, а ее молекулярная масса равна 13 680; в молекуле имеется четыре дисульфидные связи. РНКаза является первым ферментом, для которого была установлена первичная структура.

На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Афинсен впервые четко сформулировал представление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой.

В 1958 г. Ф. Ричардс показал, что в определенных условиях субтилизин расщепляет в РНКазе пептидную связь Ala-20 - Ser-21. Образующиеся фрагменты были названии S-пептидом (остатки 1-20) и S-белком (остатки 21-124); за счет нековалентных взаимодействий фрагменты образуют комплекс, названный РНКазой S. Этот комплекс обладает почти полной каталитической активностью нативного фермента; в изолированном виде S-пептид и S-белок неактивны. Далее было установлено, что синтетический пептид, идентичный по последовательности фрагменту S-пептида, содержащий остатки с 1 по 13, восстанавливает активность S-белка, однако более короткий пептид, содержащий остатки с 1 по 11, такой способностью не обладает. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что соответствующие остатки His-12 или Met-13 (или оба этих остатка) входят в активный центр фермента.

При исследовании влияния рН на активность РНКазы была выяснена важная роль функциональных групп белка с рК 5,2 и 6,8; это позволяло предполагать участие в каталитическом процессе остатков гистидина.

При карбоксилировании РНКазы иодацетатом при рН 5,5, т.е. в условиях, при которых преимущественно происходит модификация остатков гистидина, наблудалась полная утрата активности; модифицированный фермент содержит 1 моль карбоксиметильных групп на 1 моль белка. В результате образуются две монокарбоксиметиленовые формы фермента. В одной форме карбоксиметилированным является остаток His-12, а в другой - His-119. Преимущественно модифицировался His-119.

Эти данные позволили предположить, что His-12 и His-119 находятся в активном центре и что модификация одного из них препятствует модификации другого.

В результате рентгеноструктурных исследований было выяснено пространственное строение РНКазы S и комплекса РНКазы S с ингибиторами. Молекула имеет форму почки, активный центр локализован в углублении, где находятся остатки His-12, His-119 и Lys-41.

Гидролиз происходит в результате сопряженного действия остатков His-12 и His-119, осуществляющих кислотно-основной катализ. На приведенной схеме указаны стадии каталитического процесса:

1. Субстрат находится в активном центре; His-12, His-119 и Lys-41 расположены около отрицательно заряженного фосфата.

2. В результате действия His-12 как основания, акцептирующего протон от 2"-ОН-группы рибозы, и His-119 как кислоты, отдающей протон атому кислорода фосфата, образуется сначала промежуточный комплекс, а затем 2",3"-циклический фосфат.

3. На место ушедшего продукта поступает вода, отдающая протон His-119, а ОН - - фосфату, одновременно протон от His-12 переходит к кислородному атому рибозы, образуется второй продукт, а фермент возвращается в исходное состояние.

Химотрипсин секретируется в форме профермента - химотрипсиногена поджелудочной железой позвоночных животных; активация профермента происходит в двенадцатиперстной кишке под действием трипсина. Физиологическая функция химотрипсина - гидролих белков и полипептидов. Химотрипсин атакует преимущественно пептидные связи, образованные карбоксильными остатками тирозина, триптофана, ценилаланина и метионани. Он эффективно гидролизует также сложные эфиры соответствующих аминокислот. Молекулярная масса химотрипсина равна 25 000, молекула содержит 241 аминокислотный остаток. Химотрипсин образован тремя полипептидными цепями, которые связаны дисульфидными мостиками.

Функциональные группы активного центра химотрипсина идентифицированы с помощью необратимых ингибиторов. Остаток Ser-195 был модифицирован диизопропилфторфосфатом и фенилметилсульфофторидом, а остаток His-122 - N-тозил-L-фенилаланин-хлорметилкетоном. Двухстадийность процесса химотрипсинового гидролиза была обнаружена при изучении кинетики гидролиза п-нитрофенилацетата.

Характерной чертой рассматриваемого процесса является образование ковалентного интермедиата - ацилфермента. Ацилируемая каталитическая группа была идентефицирована - остаток Ser-195. Механизм катализа, осуществляемого ферментом, был предложен еще до установления пространственной структуры белка, но позднее был уточнен. В частности, исследования с помощью 18 Н 2 О позволили доказать образование ацилфермента при гидролизе пептидов.

Трехмерная структура с разрешением 0,2 нм была установлена методом рентгеноструктурного анализа Д.Блоу. в 1976г. Молекула имеет форму эллипсоида с осями 5,4*4*4 нм. Результаты кристаллографических исследований подтвердили предположения о том, что остатки Ser-195 и His-57 сближены. Гидроксильная группа Ser-195 находится на расстоянии?0,3 нм орт атома азота имидазольного кольца His-57. Наиболее интересным оказалось то обстоятельство, что атом азота в положении 1 кольца находится на расстоянии?0,28 нм от атома кислорода карбоксильной группы боковой цепи Asp-102 и занимает положение, благоприятное для образования водородной связи.

Следует отметить, что химические исследования не могли выявить участия Asp-102 в функционировании активного центра, поскольку этот остаток погружен вглубь молекулы.

В настоящее время считается, что три остатка Asp-102, His-57 и Ser-195 образуют систему переноса заряда, которая играет решающую роль в процессе катализа. Функционирование системы обеспечивает эффективное участие His-57 в катализе в качестве кислотно-основного катализатора и повышает реакционную способность Ser-195 к карбоксильному углероду атакуемой связи.

Ключевым элементом катализа является перенос протона от Ser-195 к His-57. Одновременно происходит атака атомом кислорода серина карбонильного атома углерода субстрата с образованием сначала промежуточного тетраэдрического соединения (1), а затем ацилфермента (2). На следующей стадии происходит деацилирование. Молекула воды поступает в систему переноса заряда, а ион ОН - одновременно атакует карбонильный атом углерода ацильной группы ацилфермента. Как и на стадии ацилирования, образуется промежуточное тетраэдрическое соединение (4). Затем His-57 поставляет протон атому кислорода Ser-195, в результате чего высвобождается ацильный продукт; он диффундирует в раствор, а фермент возвращается в исходное состояние.

Карбоксипептидаза А секретируется в виде профермента поджелудочной железой позвоночных животных. Образование активного фермента происходит в тонком кишечнике при участии химотрипсина. Фермент последовательно отщепляет от пептидной цепи остатки С-концевых аминокислот, т.е. является экзопептидазой.

Карбоксипептидаза А образована одиночной полипептидной цепью, содержащей 307 аминокислотных остатков; молекулярная масса равна 34 470. Аминокислотная последовательность белка была установлена в 1969 г. Р. Бредщоу.

Выяснение механизма действия фермента оказалось возможным только после проведения рентгеноструктурных исследований. Пространственная структура фермента и его комплекса с дипептидом Gly-Tyr (модель субстрата) была установлена У. Липскомбом. Молекула фермента имеет форму эллипсоида с осями 5,0*4,2*3,8 нм; активный центр находится в углублении, переходящем в глубокий неполярный карман. В зоне активного центра локализован ион цинка (его лигандами являются боковые цепи остатков Glu-72, His196, His-69 и молекула воды), а также функциональные группы, участвующие в связывании субстрата и катализе, - остатки Arg-145, Glu-270 и Tyr-248.

При сравнительном анализе структур фермента и его комплекса с Gly-Tyr была получена важная информация о строении фермент-субстратного комплекса. В частности, установлено, что при образовании комплекса гидроксильная группа Tyr-248 перемещается на 1,2 нм по отношению к своему положению в свободном ферменте (т.е. примерно на 1/3 диаметра молекулы).

Согласно схеме каталитического процесса, карбоксилатная группа Glu-270 активирует молекулу воды, находящуюся в сфере реакции, оттягивая от нее протон; образующийся ион ОН- осуществляет нуклеофильную атаку на карбонильный углерод расщепляемой связи. Одновременно гидроксильная группа Tyr-248, находящаяся около атома азота расщепляемой пептидной связи, отдает ему протон. В результате атакуемая пептидная связь расщепляется и образующиеся продукты уходят из зоны активного центра. Приведенная схема иллюстрирует общий основный катализ.

Аспартатаминотрансфераза катализирует обратимую реакцию трансаминирования.

Ферментативная реакция трансаминирования была открыта А.Е. Браунштейном и М.Г. Крицман в 1937г. при изучении ферментного препарата из мышцы голубя. В последующих исследованиях было показано, что реакции трансаминирования широко распространены в живой природе и играют важную роль в сопряжении азотистого и энергетического обмена.

В 1945 г. было установлено, что пиридоксаль-5"-фосфат (ПЛФ) является коферментом аминотрансфераз. Молекула ААТ является димером, образованным идентичными субъединицами. В сердечной мышце исследованных позвоночных имеются два изофермента - цитоплазматическая (цААТ0 и митохондриальная (мААТ) аминотрансферазы.

Первичная структура цААТ из сердечной мышцы была установлена в 1972г. Ю.А. Овчинниковым и А.Е. Брайнштейном. Полипептидная цепь белка содержит 412 аминокислотных остатков; молекулярная масса равна 46 000.

Общая теория пиридоксалевого катализа была разработана А.Е. Браунштейном и М.М. Шемякиным в 1952-1953 гг., а несколько позднее - Д.Е. Мецлером и Е.Е. Снеллом. Согласно этой теории, каталитическое действие пиридоксалевых ферментовобусловлено способностью альдегидной группы пиридоксальфосфата образовывать при взаимодействии с аминами, в том числе с аминокислотами, альдимины (шиффовы основания).

В образующейся фосфопиридоксилденаминокислоте имеется система сопряженных двойных связей, по которой происходит смещение электронов от б-углеродного атома облегчает разрыв связей, образованных этим атомом.

Современные представления о механизме ферментативного трансаминирования, разработанные А.Е. Браунштейном и его сотрудниками, являются развитием рассмотренной выше теории. В исходном состоянии альдегидная группа пиридоксальфосфата образует альдиминную связь с е-аминогруппой остатка Lys-258 активного центра (I). При связывании аминокислоты образуется комплекс Михаэлиса (II), а затем альдимин между пиридоксальфосфатом и субстратом (III). В результате последующих превращений через промежуточные стадии (IV) и (V) образуется оксокислота (VI). Этим заканчивается первая полуреакция трансаминирования. Повторение этих же стадий в «обратном направлении» с новой оксикислотой составляет вторую полуреакцию, завершающую каталитический цикл трансаминирования.

Миоглобин и гемоглобин

Эти два белка часто называют дыхательными ферментами. Взаимодействие их с субстратом - кислородом выснено детально, прежде всего на основе рентгеноструктурного анализа высокого разрешения. Трехмерная структура миоглобина была определениа Дж. Кендрью в 1961г., а трехмерная структура гемоглобина - М. Перутцем в 1960 г.

Молекула миоглобина имеет компактную форму - 4,5*3,5*2,5 нм, полипептидная цепь образует 8 спирализованных участков, обозначаемых буквами от А до Н. Она специализированным образом уложена вокруг большого плоского железосодержащего кольца гема. Гем - это комплекс порфирина с двухвалентным железом.

Полярные цепи пропионовой кислоты гема находятся на поверхности молекулы, остальная часть гема погружена в глобулу. Связь гема с белком осуществляется за счет координационной связи между атомом железа и атомом гистидина, локализованного в спирали F; это так называемый проксимальный гистидин. В гемовом кармане в составе спирали Е локализован другой важный остаток гистидина - дистальный гистидин; он находится с противоположной стороны от атома железа на большем расстоянии, чем проксимальный гистидин. Область между железом гена и дистальным гистидином в дизоксимиоглобине свободна, и липофильная молекула О 2 может связываться с железом гема, занимая шестое координационное положение. Уникальной особенностью миоглобина, а также гемоглобина, является их способность обратимо связывать О 2 без окисления гемового Fe 2+ в Fe 3+ . Это оказывается возможным, поскольку в гидрофобном гемовом карман, из которого вытеснена вода, создается среда с низкой диэлектрической проницаемостью.

При связывании О 2 с атомом железа последний перемещается примерно на 0,06 нм и оказывается в плоскости порфиринового кольца, т.е. в энергетически более выгодном положении. Предполагают, что это перемещение обусловлено тем, что ион Fe 2+ в дезоксимиоглобине находится в высокоспиновом состоянии и радиус его является слишком большим, чтобы он мог разместиться в плоскости порфиринового кольца гема. При связывании же О 2 ион Fe 2+ переходит в низкомпиновое состояние и его радиус уменьшается; теперь ион Fe 2+ может переместиться в плоскость порфиринового кольца.

Гемоглобин - основной компонент эритроцитов крови, осуществляющий доставку кислорода от легких к тканям, а углекислоты - из тканей в легкие. Гемоглобины разных видов отличаются по форме кристаллов, растворимости, сродству к кислороду. Это обусловлено различиями в аминокислотной последовательности белков; гемовый компонент одинаков у гемоглобинов всех видов позвоночных и некоторых беспозвоночных животных.

Гемоглобин человека представляет собой тетрамер, состоящий из четырех субъединиц, двух б-субъединиц и двух в-субъединиц, содержащих по 141 и 146 аминокислотных остатков соответственно. Между первичными структурами б- и в-субъединиц существует значительная гомология, сходны также и конформация их полипептидных цепей.

Молекула гемоглобинаимеет сферическую форму, диаметр которой равен 5,5 нм. Четыре субъединицы упакованы в форме тетраэдра.

Данные рентгеноструктурного анализа показали, что оксигенирование гемоглобина сопровождается рядом изменений. При низком разрешении установлено, что в этом случае структура становится более компактной (атомы Fe в-цепей сближаются примерно на 0,6-0,7 нм), субъединицы поворачиваются друг относительно друга и оси второго порядка на 10-15 о. Результаты исследования при высоком разрешении свидетельствуют о том, что особенно значительные изменения происходят в области бв-контактов.

К настоящему времени на основе рентгеноструктурных исследований и ряда других методических подходов достигнуты значительные успехи в выяснении механизма действия ферментов с заданными свойствами на основе достижений в области генной инженерии. Это открывает широкие возможности для проверки справедливости современных представлений о механизме действия ферментов и создания фундаментальной теории ферментативного катал.

Первая ферментативная реакция осахаривания крахмала солодом была исследована отечественным учёным К. Ментен разработали теорию ферментативного катализа. Самнер впервые выделил очищенный препарат фермента уреазы в кристаллическом состоянии. Меррифилду удалось осуществить искусственный синтез фермента РНК-азы.

Поделитесь работой в социальных сетях

Если эта работа Вам не подошла внизу страницы есть список похожих работ. Так же Вы можете воспользоваться кнопкой поиск

Реферат

СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Краткая история ферментологии

Экспериментальное изучение ферментов в 19 веке совпало по времени с изучением процессов дрожжевого брожения, что нашло отражение в терминах «ферменты» и «энзимы». Название ферменты возникло от латинского слова fermentatio – брожение. Термин энзимы произошёл от понятия en zyme - из дрожжей. Вначале этим названиям придавали разный смысл, но в настоящее время они являются синонимами.

Первая ферментативная реакция осахаривания крахмала солодом была исследована отечественным учёным К.С. Кирхгоффом в 1814 году. Впоследствии были предприняты попытки выделения ферментов из дрожжевых клеток (Э. Бюхнер, 1897 год). В начале ХХ века Л. Михаэлис и М. Ментен разработали теорию ферментативного катализа. В 1926 году Д. Самнер впервые выделил очищенный препарат фермента уреазы в кристаллическом состоянии. В 1966 году Б. Меррифилду удалось осуществить искусственный синтез фермента РНК-азы.

Структура ферментов

Ферменты – это высокоспециализированные белки, способные повышать скорость реакции в живых организмах. Ферменты - биологические катализаторы.

Все ферменты являются белками, как правило, глобулярными. Они могут относиться как к простым, так и к сложным белкам. Белковая часть фермента может состоять из одной полипептидной цепи – мономерные белки – ферменты (например, пепсин). Ряд ферментов являются олигомерными белками, включают в свой состав несколько протомеров или субъединиц. Протомеры, объединяясь в олигомерную структуру, соединяются самопроизвольно непрочными нековалентными связями. В процессе объединения (кооперации) происходят структурные изменения отдельных протомеров, в результате чего активность фермента заметно возрастает. Отделение (диссоциация) протомеров и их объединение в олигомерный белок является механизмом регуляции активности ферментов.

Субъединицы (протомеры) в олигомерах могут быть или одинаковыми или отличающимися по первичной - третичной структуре (конформации). В случае соединения различных протомеров в олигомерную структуру фермента возникают множественные формы одного и того же фермента – изоферменты .

Изоферменты катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по набору субъединиц, физико-химическим свойствам, электрофоретической подвижности, по сродству к субстратам, активаторам, ингибиторам. Например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – фермент, окисляющий молочную кислоту в пировиноградную кислоту, является тетрамером. Он состоит из четырёх протомеров двух типов. Один вид протомеров обозначается Н (выделен из сердечной мышцы), второй протомер обозначается М (выделен из скелетной мускулатуры). Возможно 5 сочетаний этих протомеров в составе ЛДГ: Н 4 , Н 3 М, Н 2 М 2 , Н 1 М 3 , М 4 .

Биологическая роль изоферментов.

• Изоферменты обеспечивают протекание химических реакций в соответствии с условиями в разных органах. Так, изофермент ЛДГ 1 – обладает высоким сродством к кислороду, поэтому он активен в тканях с высокой скоростью окислительных реакций (эритроциты, миокард). Изофермент ЛДГ 5 активен в присутствии высокой концентрации лактата, наиболее характерен для ткани печени
• Выраженная органоспецифичность используется для диагностики заболеваний различных органов.
• Изоферменты изменяют свою активность с возрастом. Так, у плода при недостатке кислорода преобладает ЛДГ 3 , а с увеличением возраста, увеличением поступления кислорода возрастает доля ЛДГ 2 .

Если фермент является сложным белком, то он состоит из белковой и небелковой части. Белковая часть является высокомолекулярной, термолябильной частью фермента и называется апоферментом . Он имеет своеобразную структуру и определяет специфичность ферментов.

Небелковая часть фермента называется кофактором (коферментом ) . Кофактором чаще всего являются ионы металлов, которые могут прочно связываться с апоферментом (например, Zn в ферменте карбоангидразе, С u в ферменте цитохромоксидазе). Коферменты чаще всего являются органическими веществами, менее прочно связанными с апоферментом. Коферментами являются нуклеотиды НАД, ФАД. Кофермент – низкомолекулярная, термостабильная часть фермента. Его роль заключается в том, что он определяет пространственную укладку (конформацию) апофермента, и определяет его активность. Кофакторы могут переносить электроны, функциональные группы, участвовать в образовании дополнительных связей между ферментом и субстратом.

В функциональном отношении в ферменте принято выделять два важных участка в молекуле фермента: активный центр и аллостерический участок

Активный центр – это участок молекулы фермента, который взаимодействует с субстратом и участвует в каталитическом процессе. Активный центр фермента образован радикалами аминокислот, удалённых друг от друга в первичной структуре. Активный центр имеет трёхмерную укладку, чаще всего в его составе выявляются

ОН группы серина

SH – цистеина

NH 2 лизина

- γ -СООН глютаминовой кислоты

В активном центре различают две зоны – зону связывания с субстратом и каталитическую зону.

Зона связывания обычно имеет жёсткую структуру, к которой комплементарно присоединяется субстрат реакции. Например, трипсин расщепляет белки в участках, богатых положительно заряженной аминокислотой лизином, так как в его зоне связывания содержатся остатки отрицательно заряженной аспарагиновой кислоты.

Каталитическая зона - это участок активного центра, непосредственно воздействующий на субстрат и осуществляющий каталитическую функцию. Это зона более подвижна, в ней возможно изменение взаиморасположения функциональных групп.

В ряде ферментов (чаще олигомерных) кроме активного центра присутствует аллостерический участок – участок молекулы фермента, удалённый от активного центра и взаимодействующий не с субстратом, а с дополнительными веществами (регуляторами, эффекторами). В аллостерических ферментах в одной субъединице может находиться активный центр, в другой - аллостерический участок. Аллостерические ферменты изменяют свою активность следующим образом: эффектор (активатор, ингибитор) действует на аллостерическую субъединицу и изменяет её структуру. Затем изменение конформации аллостерической субъединицы по принципу кооперативных изменений опосредованно меняет структуру каталитической субъединицы, что сопровождается изменение активности фермента.

Механизм действия ферментов.

Ферменты обладают рядом общекаталитических свойств:

• не смещают каталитическое равновесие
• не расходуются в процессе реакции
• катализируют только термодинамически реальные реакции. Такими реакциями являются те, в которых исходный энергетический запас молекул больше, чем финальный.

В ходе реакции преодолевается высокий энергетический барьер. Разница между энергией этого порога и исходным энергетическим уровнем - энергия активации.

Скорость ферментативных реакций определяется энергией активации и рядом других факторов.

Константа скорости химической реакции определяется по уравнению:

К = P*Z*e - (Ea / RT )

К - константа скорости реакции

Р – пространственный (стерический) коэффициент

Z – количество взаимодействующих молекул

Е а – энергия активации

R – газовая постоянная

Т – универсальная абсолютная температура

е – основание натуральных логарифмов

В этом уравнении Z , е, R , T – постоянные величины, а Р и Еа - переменные. Причём, между скоростью реакции и стерическим коэффициентом зависимость прямая, а между скоростью и энергией активации – обратная и степенная зависимость (чем ниже Еа, тем выше скорость реакции).

Механизм действия ферментов сводится к увеличению ферментами стерического коэффициента и уменьшению энергии активации.

Снижение ферментами энергии активации.

Например, энергия расщепления Н 2 О 2 без ферментов и катализаторов – 18 000 ккал на моль. Если используется платина и высокая температура, она снижается до 12 000 ккал/моль. При участии фермента каталазы энергия активации составляет лишь 2 000 ккал/моль.

Уменьшение Еа происходит в результате образования промежуточных фермент-субстратных комплексов по схеме: F + S <=> FS -комплекс → F + продукты реакции. Впервые возможность образования фермент- субстратных комплексов была доказана Михаэлисом, Ментеном. Впоследствии многие фермент-субстратные комплексы были выделены. Для объяснения высокой избирательности ферментов при взаимодействии с субстратом предложена теория «ключа и замка» Фишера . Согласно ей, фермент взаимодействует с субстратом только при абсолютном соответствии их друг другу (комплементарность) наподобие ключа и замка. Данная теория объясняла специфичность ферментов, но не раскрывала механизмы их воздействия на субстрат. Позже разработана теория индуцированного соответствия фермента и субстрата - теория Кошланда (теория «резиновой перчатки»). Её суть состоит в следующем: активный центр фермента сформирован и содержит все функциональные группы ещё до взаимодействия с субстратом. Однако эти функциональные группы находятся в неактивном состоянии. В момент присоединения субстрата ониндуцирует изменения положения, структуры радикалов в активном центре фермента. В результате активный центр фермента под действием субстрата переходит в активное состояние и, в свою очередь, начинает воздействовать на субстрат, т.е. происходит взаимодействие активного центра фермента и субстрата. Вследствие этого субстрат переходит в нестабильное, неустойчивое состояние, что ведёт к уменьшению энергии активации.

Взаимодействие фермента и субстрата может заключаться в реакциях нуклеофильного замещения, электрофильного замещения, дегидратации субстрата. Возможно также кратковременное ковалентное взаимодействие функциональных групп фермента с субстратом. В основном происходит геометрическая переориентация функциональных групп активного центра.

Увеличение ферментами стерического коэффициента.

Стерический коэффициент вводится для реакций, в которых участвуют крупные молекулы, имеющие пространственную структуру. Стерический коэффициент показывает долю удачных столкновений активных молекул. Например, он равен 0,4, если 4 из 10 столкновений активных молекул привели к образованию продукта реакции.

Ферменты увеличивают стерический коэффициент, так как они изменяют строение молекулы субстрата в фермент - субстратном комплексе, в результате чего комплементарность фермента и субстрата возрастает. Кроме того, ферменты за счёт своих активных центров упорядочивают расположение молекул субстрата в пространстве (до взаимодействия с ферментом молекулы субстрата располагаются хаотично) и облегчают протекание реакции.

Номенклатура ферментов

Ферменты имеют несколько типов названий.

1. Тривиальные названия (трипсин, пепсин)
2. Рабочая номенклатура. В этом названии фермента присутствует окончание – аза, которое прибавляется:
   • к названию субстрата (сахараза, амилаза),
   • к виду связи, на которую действует фермент (пептидаза, гликозидаза),
   • к типу реакции, процесса (синтетаза, гидролаза).

3) У каждого фермента есть классификационное название, в котором отражается тип реакции, вид субстрата и кофермента. Например: ЛДГ – L лактат-НАД + - оксидоредуктаза.

Классификация ферментов.

Классификация ферментов разработана в 1961 году. Согласно классификации каждый фермент расположен в определённом классе, подклассе, подподклассе и имеет порядковый номер. В связи с этим каждый фермент имеет цифровой шифр, в котором первая цифра обозначает класс, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая – порядковый номер (ЛДГ: 1,1,1,27). Все ферменты классифицируются на 6 классов.

1. Оксидоредуктазы
2. Трансферазы
3. Гидролазы
4. Лиазы
5. Изомеразы
6. Синтетазы (лигазы)

Оксидоредуктазы .

Ферменты, катализирующие окислительно - востановительные процессы. Общий вид реакции: А ок + В вос = А вост +В ок . Этот класс ферментов включает несколько подклассов:

1. Дегидрогиназы, катализируют реакции путём отщепления водорода от окисляемого вещества. Они могут быть аэробными (переносят водород на кислород) и анаэробными (переносят водород не на кислород, а на какое-то другое вещество).

2. Оксигеназы - ферменты катализирующие окисление путём присоединение кислорода к окисляемому веществу. Если присоединяется один атом кислорода, участвуют монооксигеназы, если два атома кислорода – диоксигеназы.

3. Пероксидазы – ферменты, катализирующие окисление веществ с участием пероксидов.

Трансферазы.

Ферменты, осуществляющие внутримолекулярный и межмолекулярный перенос функциональных групп с одного вещества на другое по схеме: АВ + С = А + ВС. Подклассы трансфераз выделяют в зависимости от вида переносимых групп: аминотрансферазы, метилтрансферазы, сульфотрансферазы, ацилтрансферазы (переносят остатки жирных кислот), фосфотрансферазы (переносят остатки фосфорной кислоты).

Гидролазы.

Ферменты этого класса катализируют разрыв химической связи с присоединением воды по месту разрыва, то есть реакции гидролиза по схеме: АВ + НОН = АН + ВОН. Подклассы гидролаз выделяют в зависимости от вида разрываемых связей: пептидазы расщепляют пептидные связи (пепсин), гликозидазы - гликозидные связи (амилаза), эстеразы – сложноэфирные связи (липаза).

Лиазы .

Лиазы катализируют разрыв химической связи без присоединения воды по месту разрыва. При этом в субстратах образуются двойные связи по схеме: АВ = А + В. Подклассы лиаз зависят от того, между какими атомами разрывается связь и какие вещества образуются. Альдолазы разрывают связь между двумя атомами углерода (например, фруктоза 1,6-ди-фосфатальдолаза «разрезает» фруктозу и две триозы). К лиазам относят ферменты декарбоксилазы (отщепляют углекислый газ), дегидратазы – «вырезают» молекулы воды.

Изомеразы .

Изомеразы катализируют взаимопревращения различных изомеров. Например, фосфогексоизимераза переводит фруктозу в глюкозу. К подклассам изомераз относятся мутазы (фосфоглюкомутаза переводит глюкозо- 1- фосфат в глюкозо-6-фосфат), эпимеразы (например, переводят рибозу в ксилулозу), таутомеразы

Синтетазы (лигазы).

Ферменты этого класса катализируют реакции синтеза новых веществ за счёт энергии АТФ по схеме: А+В+АТФ = АВ. Например, глютаминсинтетаза соединяет глютаминовую кислоту, NH 3 + при участии АТФ с образованием глютамина.

Свойства ферментов.

Ферменты, помимо общих с неорганическими катализаторами, свойств имеют определённые отличия от неорганических катализаторов. К ним относятся:

• более высокая активность
• более высокая специфичность
• более мягкие условия для катализа
• способность к регуляции активности

Высокая каталитическая активность ферментов .

Ферменты отличаются высокой каталитической активностью. Например, одна молекула карбоангидразы за одну минуту катализирует образование (или расщепление) 36 миллионов молекул угольной кислоты (Н 2 СО 3 ). Высокая активность ферментов объясняется механизмом их действия: они уменьшают энергию активации и увеличивают пространственный (стерический коэффициент). Высокая активность ферментов имеет важное биологическое значение, состоящее в том, что они обеспечивают высокую скорость химических реакций в организме.

Высокая специфичность ферментов .

Все ферменты обладают специфичностью, однако степень специфичности в разных ферментах различна. Выделяют несколько видов специфичности ферментов.

Абсолютная субстратная специфичность, при которой фермент действует только на одно определённое вещество. Например, фермент уреаза расщепляет только мочевину.

Абсолютная групповая специфичность, при которой фермент оказывает один и тот же каталитический эффект на группу соединений, близких по структуре. Например, фермент алкогольдегидрогеназа окисляет не только С 2 Н 5 ОН, но и его гомологи (метиловый, бутиловый и другие спирты).

Относительная групповая специфичность, при которой фермент осуществляет катализ разных классов органических веществ. Например, фермент трипсин проявляет пептидазную и эстеразную активность.

Стереохимическая специфичность (оптическая специфичность), при которой расщепляется только определённая форма изомеров (D , L формы, α, β, цис - трансизомеры). Например, ЛДГ действует только на L -лактат, L -аминокислотоксидазы действуют на L -изомеры аминокислот.

Высокая специфичность объясняется уникальной для каждого фермента структурой активного центра.

Термолябильность ферментов.

Термолябильность - зависимость активности ферментов от температуры. При повышении температуры от 0 до 40 градусов активность ферментов растёт согласно правилу Вант-Гоффа (при возрастании температуры на 10 градусов скорость реакции увеличивается в 2 – 4 раза). При дальнейшем повышении температуры активность ферментов начинает снижаться, что объясняется тепловой денатурацией белковой молекулы фермента. Графически термозависимость ферментов имеет вид:

Инактивация фермента при 0 градусов обратима, а при высокой температуре инактивация приобретает необратимый характер. Это свойство ферментов определяет максимальную скорость реакции в условиях температуры тела человека. Термолябильность ферментов должна учитываться в практической медицинской деятельности. Например, при проведении ферментативной реакции в пробирке, необходимо создавать оптимальную температуру. Это свойство ферментов может быть применено в криохирургии, когда сложная длительная операция проводится при снижении температуры тела, что замедляет скорость протекающих в организме реакций, снижает потребление кислорода тканями. Хранить ферментативные препараты необходимо при пониженной температуре. Для обезвреживания, обеззараживания микроорганизмов используют высокие температуры (автоклавирование, кипячение инструментария).

Фотолябильность .

Фотолябильность - зависимость активности ферментов от действия ультрафиолетовых лучей. УФЛ вызывают фотоденатурацию белковых молекул и уменьшают активность ферментов. Это свойство ферментов используют в бактерицидном эффекте ультрафиолетовых ламп.

Зависимость активности от рН.

У всех ферментов есть определённый интервал рН, в котором активность фермента максимальна - оптимум рН. Для многих ферментов оптимум около 7. В то же время, для пепсина оптимальная среда 1-2, для щелочной фосфатазы около 9. При отклонении рН от оптимума активность фермента снижается, что видно из графика. Это свойство ферментов объясняется изменением ионизации ионогенных групп в молекулах фермента, что ведёт к изменению ионных связей в молекуле белковой молекулы фермента. Это сопровождается изменением конформации молекулы фермента, а это, в свою очередь, приводит к изменению его активности. В условиях организма рН - зависимость определяет максимальную активность ферментов. Это свойство находит и практическое применение. Ферментативные реакции вне организма проводятся при оптимуме рН. При сниженной кислотности желудочного сока с лечебной целью назначают раствор НС l .

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и концентрации субстрата

Зависимость скорости реакции от концентрации фермента и концентрации субстрата (кинетика ферментативных реакций) представлена на графиках.

График 1 график 2

В ферментативной реакции (F + S 2  1 FS → 3 F + P ) выделяют скорости трёх составляющих этапов:

1- образование фермент-субстратного комплекса FS ,

2- обратный распад фермент – субстратного комплекса,

3 – распад фермент-субстратного комплекса с образованием продуктов реакции. Скорость каждой из этих реакций подчиняется закону действующих масс:

V 1 = К 1 [ F ]* [ S ]

V 2 = K 2 * [ FS ]

V 3 = K 3 *[ FS ]

В момент равновесия скорость реакции образования FS равна сумме скоростей его распада: V 1 = V 2 + V 3 . Из трёх этапов ферментативной реакции наиболее важным и медленным является третий , так как он связан с образованием продуктов реакции. По приведенной выше формуле найти скорость V 3 невозможно, так как фермент- субстратный комплекс очень неустойчив измерение его концентрациизатруднено. В связи с этим, Михаэлис-Ментен ввели К m – константу Михаэлиса и преобразовали уравнение для измерения V 3 в новое уравнение, в котором присутствуют реально измеримые величины:

V 3 = K 3 * [ F 0 ] * [S] / Km + [S] или V 3 =V max * [S] / Km+[S]

[ F 0 ] – исходная концентрация фермента

К m – константа Михаэлиса.

Физический смысл К m : К m = (К 2 +К 3 ) /К 1 . Она показывает соотношение констант скоростей распада фермент-субстратного комплекса и константы скорости его образования.

Уравнение Михаэлиса-Ментен является универсальным. Оно иллюстрирует зависимость скорости реакции от [ F 0 ] от [ S ]

1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. Эта зависимость выявляется при малых концентрациях субстрата [ S ]< Km . В этом случае концентрацией субстрата в уравнении можно пренебречь и уравнение приобретает вид: V 3 = K 3* [ F 0 ] * [ S ] / Km . В данном уравнении K 3 , F 0 ], Km – константы и могут быть заменены новой константой К*. Таким образом, при малой концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна этой концентрации V 3 = K * * [ S ]. Эта зависимость соответствует первому участку графика 2.
2. Зависимость скорости от концентрации фермента проявляется при высокой концентрации субстрата. S ≥ Km . В этом случае можно пренебречь Km и уравнение преобразуется в следующее: V 3 = K 3* (([ F 0 ] * [ S ]) /[ S ]) = K 3* [ F 0 ] = V max . Таким образом, при высокой концентрации субстрата скорость реакции определяется концентрацией фермента и достигает максимального значения V 3 = K 3 [ F 0 ]= V max . (третий участок графика 2).
3. Позволяет определить численное значение Km при условии V 3 = V max /2. В этом случае уравнение приобретает вид:

V max /2 = ((V max *[ S ])/ Km +[ S ]), откуда следует, что Km =[ S ]

Таким образом, К m численно равна концентрации субстрата при скорости реакции, равной половине максимальной. К m является очень важной характеристикой фермента, она измеряется в молях (10 -2 – 10 -6 моль) и характеризуют специфичность фермента: чем ниже Km , тем выше специфичность фермента.

Графическое определение константы Михаэлиса.

Удобнее использовать график, представляющий прямую линию. Такой график предложен Лайнуивером – Берком (график двойных обратных величин), который соответствует обратному уравнению Михаэлиса - Ментен

Зависимость скорости ферментативных реакций от присутствия активаторов и ингибиторов.

Активаторы – вещества, повышающие скорость ферментативных реакций. Различают специфические активаторы, повышающие активность одного фермента (НС l - активатор пепсиногена) и неспецифические активаторы, увеличивающие активность целого ряда ферментов (ионы Mg – активаторы гексокиназы, К, Na –АТФ-азы и других ферментов). В качестве активаторов могут служить ионы металлов, метаболиты, нуклеотиды.

Механизм действия активаторов .

1. Достраивание активного центра фермента, в результате чего облегчается взаимодействие фермента с субстратом. Таким механизмом обладают в основном ионы металлов.
2. Аллостерический активатор взаимодействует с аллостерическим участком (субъединицей) фермента, через его изменения опосредованно изменяет структуру активного центра и увеличивает активность фермента. Аллостерическим эффектом обладают метаболиты ферментативных реакций, АТФ.
3. Аллостерический механизм может сочетаться с изменением олигомерности фермента. Под действием активатора происходит объединение нескольких субъединиц в олигомерную форму, что резко увеличивает активность фермента. Например, изоцитрат является активатором фермента ацетил-КоА карбоксилазы.
4. Фосфолирирование - дефосфолирирование ферментов относится к обратимой модификации ферментов. Присоединение Н 3 РО 4 чаще всего резко увеличивает активность фермента. Например, два неактивных димера фермента фосфорилазы соединяются с четырьмя молекулами АТФ и образуют активную тетрамерную фосфорилированную форму фермента. Фосфолирирование ферментов может сочетаться с изменением их олигомерности. В некоторых случаях фосфорилирование фермента, наоборот, снижает его активность (например, фосфорилирование фермента гликогенсинтетазы)
5. Частичный протеолиз (необратимая модификация). При этом механизме от неактивной формы фермента (профермента) отщепляется фрагмент молекулы, блокирующий активный центр фермента. Например, неактивный пепсиноген под действием HCL переходит в активный пепсин.

Ингибиторы – вещества, понижающие активность фермента.

По специфичности выделяют специфичные и неспецифичные ингибиторы

По обратимости эффекта различают обратимые и необратимые ингибиторы.

По месту действия встречаются ингибиторы, действующие на активный центр и вне активного центра.

По механизму действия различают на конкурентные и неконкурентные ингибиторы.

Конкурентное ингибирование .

Ингибиторы этого типа имеют структуру, близкую к структуре субстрата. В силу этого ингибиторы и субстрат конкурируют за связывание активного центра фермента. Конкурентное ингибирование - это обратимое ингибирование Эффект конкурентного ингибитора может быть уменьшен путём повышения концентрации субстрата реакции

Примером конкурентного ингибирования может служить угнетение активности сукцинатдегидрогеназы, катализирующей окисление дикарбоновой янтарной кислоты, дикарбоновой малоновой кислотой, сходной по структуре с янтарной кислотой.

Принцип конкурентного ингибирования широко используется при создании лекарственных средств. Например, сульфаниламидные препараты имеют структуру, близкую к структуре парааминобензойной кислоты, необходимой для роста микроорганизмов. Сульфаниламиды блокируют ферменты микроорганизмов, необходимые для усвоения парааминобензойной кислоты. Некоторые противоопухолевые препараты являются аналогами азотистых оснований и, тем самым, ингибируют синтез нуклеиновых кислот (фторурацил).

Графически конкурентное ингибирование имеет вид:

Неконкурентное ингибирование .

Неконкурентные ингибиторы структурно не имеют схожести с субстратами реакций и поэтому не могут вытесняться при высокой концентрации субстрата. Существует несколько вариантов действия неконкурентных ингибиторов:

1. Блокирование функциональной группы активного центра фермента и, вследствие этого, уменьшение активности. Например, активность S Н - групп могут связывать тиоловые яды обратимо (соли металлов, ртути, свинца) и необратимо (монойодацетат). Эффект ингибирования тиоловых ингибиторов может быть уменьшен введением добавочных веществ, богатых SH группами (например, унитиол). Встречаются и используются сериновые ингибиторы, блокирующие ОН - группы активного центра ферментов. Таким эффектом обладают органические фосфофторсодержащие вещества. Эти вещества могут, в частности, ингибировать ОН - группы в ферменте ацетилхолинэстеразе, разрушающей нейромедиатор ацетилхолин.
2. Блокирование ионов металлов, входящих в состав активного центра ферментов. Например, цианиды блокируют атомы железа, ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) блокирует ионы Са, Mg .
3. Аллостерический ингибитор взаимодействует с аллостерическим участком, опосредованно через него по принципу кооперативности, меняя структуру и активность каталитического участка. Графически неконкурентное ингибирование имеет вид:

Максимальная скорость реакции при неконкурентном ингибировании не может быть достигнута путём повышения концентрации субстрата.

Регуляция активности ферментов в процессе метаболизма.

Адаптация организма к меняющимся условиям (режим питания, экологические воздействия и пр.) возможна благодаря изменению активности ферментов. Существует несколько возможностей регуляции скорости ферментных реакций в организме:

1. Изменение скорости синтеза ферментов (этот механизм требует длительного отрезка времени).
2. Увеличение доступности субстрата и фермент путём изменения проницаемости клеточных мембран.
3. Изменение активности ферментов, уже имеющихся в клетках и тканях. Этот механизм осуществляется с большой скоростью и носит обратимый характер.

В многоступенчатых ферментативных процессах выделяют регуляторные, ключевые ферменты, которые ограничивают суммарную скорость процесса. Чаще всего это ферменты начальной и конечной стадий процесса. Изменение активности ключевых ферментов происходит по различным механизмам.

1. Аллостерический механизм:

1. Изменение олигомерности фермента:

Мономеры не активные ↔ олигомеры активные

1. Фосфолирирование - дефосфорилирование:

Фермент (неактивный) + Н 3 РО 4 ↔ фосфорилированный активный фермент.

В клетках широко распространён авторегуляторный механизм. Авторегуляторным механизмом является, в частности, ретроингибирование, при котором продукты ферментативного процесса угнетают ферменты начальных стадий. Например, высокие концентрации пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов угнетают начальные в стадии их синтеза.

Иногда исходные субстраты активируют конечные ферменты, на схеме: субстрат А активирует F 3 . Например, активная форма глюкозы (глюкозо-6-фосфат) активирует конечный фермент синтеза гликогена из глюкозы (гликогенсинтетазу).

Структурная организация ферментов в клетке

Слаженность обменных процессов в организме возможна благодаря структурной разобщенности ферментов в клетках. Отдельные ферменты располагаются в тех или иных внутриклеточных структурах – компартментализация. Например, в плазматической мембране активен фермент калий - натриевая АТФ-аза. В митохондриях активны ферменты окислительных реакций (сукцинатдегидрогеназа, цитохромоксидаза). В ядре активны ферменты синтеза нуклеиновых кислот (ДНК-полимераза). В лизосомах активны ферменты расщепления различных веществ (РНК - аза, фосфатаза и другие).

Ферменты, наиболее активные в данной клеточной структуре, называются индикаторными или маркерными ферментами. Их определение в клинической практике отражает глубину структурных повреждений ткани. Некоторые ферменты объединяются в полиферментные комплексы, например, пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК), осуществляющий окисление пировиноградной кислоты.

Принципы обнаружения и количественного определения ферментов:

Обнаружение ферментов основано на их высокой специфичности. Ферменты обнаруживают по производимому ими действию, т.е. по факту протекания той реакции, которую катализирует данный фермент. Например, амилазу обнаруживают по реакции расщепления крахмала до глюкозы.

Критериями протекания ферментативной реакции могут быть:

• исчезновение субстрата реакции
• появление продуктов реакции
• изменение оптических свойств кофермента.

Количественное определение ферментов

Так как концентрация ферментов в клетках очень низка, то определяют не их истинную концентрацию, а о количестве фермента судят косвенно, по активности фермента.

Активность ферментов оценивают по скорости ферментативной реакции, протекающей в оптимальных условиях (оптимум температуры, РН, избыточно высокая концентрация субстрата). В этих условиях скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (V = K 3 [ F 0 ]).

Единицы активности (количества) фермента

В клинической практике используют несколько единиц активности фермента.

1. Международная единица – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата за минуту при температуре 25 0 С.
   1. Катал (в системе СИ) – то количество фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата за секунду.
   2. Удельная активность – отношение активности фермента к массе белка фермента.
   3. Молекулярная активность фермента показывает, сколько молекул субстрата превращается под действием 1 молекулы фермента.

Клиническая ферментология

Применение сведений о ферментах в медицинской практике составляет раздел медицинской энзимологии. Она включает 3 раздела:

1. Энзимодиагностика
   1. Энзимопотология
      1. Энзимотерапия

Энзимодиагностика – раздел, изучающий возможности исследования активности ферментов для диагностики заболеваний. Для оценки повреждения отдельных тканей используют органоспецифические ферменты, изоферменты.

В педиатрической практике при проведении ферментодиагностики необходимо учитывать детские особенности. У детей активность некоторых ферментов выше, чем у взрослых, Например, высокая активность ЛДГ отражает преобладание анаэробных процессов в раннем постнатальном периоде. Содержание трансаминаз в плазме крови детей повышено в результате увеличенной сосудисто-тканевой проницаемости. Активность глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы увеличена в результате усиленного распада эритроцитов. Активность других ферментов, наоборот, ниже, чем у взрослых. Например, активность пепсина, ферментов поджелудочной железы (липазы, амилазы) снижена в силу незрелости секреторных клеток.

С возрастом возможно перераспределение отдельных изоферментов. Так, у детей преобладает ЛДГ 3 (более анаэробная форма), а у взрослых ЛДГ 2 (более аэробная форма).

Энзимопатология – раздел ферментологии, изучающий заболевания, ведущим механизмом развития которых является нарушение активности ферментов. К ним относятся нарушения обмена углеводов (галактоземия, гликогенозы, мукополисахаридозы), аминокислот (фенилкетонурия, цистинурия), нуклеотидов (оротатацидурия), порфиринов (порфирии).

Энзимотерапия – раздел ферментологии, изучающий применение ферментов, коферментов, активаторов, ингибиторов с лечебными целями. Ферменты могут применяться с заместительной целью (пепсин, ферменты поджелудочной железы), с литической целью для удаления некротических масс, тромбов, для разжижения вязких экссудатов.

Литература

1. Авдеева, Л.В. Биохимия: Учебник / Л.В. Авдеева, Т.Л. Алейникова, Л.Е. Андрианова; Под ред. Е.С. Северин. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2013. - 768 c.

2. Ауэрман, Т.Л. Основы биохимии: Учебное пособие / Т.Л. Ауэрман, Т.Г. Генералова, Г.М. Суслянок. - М.: НИЦ ИНФРА-М, 2013. - 400 c.

3. Базарнова, Ю.Г. Биохимические основы переработки и хранения сырья животного происхождения: Учебное пособие / Ю.Г. Базарнова, Т.Е. Бурова, В.И. Марченко. - СПб.: Просп. Науки, 2011. - 192 c.

4. Баишев, И.М. Биохимия. Тестовые вопросы: Учебное пособие / Д.М. Зубаиров, И.М. Баишев, Р.Ф. Байкеев; Под ред. Д.М. Зубаиров. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 960 c.

5. Бокуть, С.Б. Биохимия филогенеза и онтогенеза: Учебное пособие / А.А. Чиркин, Е.О. Данченко, С.Б. Бокуть; Под общ. ред. А.А. Чиркин. - М.: НИЦ ИНФРА-М, Нов. знание, 2012. - 288 c.

6. Гидранович, В.И. Биохимия: Учебное пособие / В.И. Гидранович, А.В. Гидранович. - Мн.: ТетраСистемс, 2012. - 528 c.

7. Голощапов, А.П. Генетико-биохимические аспекты адаптации человека к условиям города с развитой химической промышленностью / А.П. Голощапов. - М.: КМК, 2012. - 103 c.

8. Гунькова, П.И. Биохимия молока и молочных продуктов / К.К. Горбатова, П.И. Гунькова; Под общ. ред. К.К. Горбатова. - СПб.: ГИОРД, 2010. - 336 c.

9. Димитриев, А.Д. Биохимия: Учебное пособие / А.Д. Димитриев, Е.Д. Амбросьева. - М.: Дашков и К, 2013. - 168 c.

10. Ершов, Ю.А. Общая биохимия и спорт: Учебное пособие / Ю.А. Ершов. - М.: МГУ, 2010. - 368 c.

11. Ершов, Ю.А. Основы биохимии для инженеров: Учебное пособие / Ю.А. Ершов, Н.И. Зайцева; Под ред. С.И. Щукин. - М.: МГТУ им. Баумана, 2010. - 359 c.

12. Камышников, В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 томах. В 2-х т.Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 томах / В.С. Камышников. - Мн.: Беларусь, 2012. - 958 c.

13. Клопов, М.И. Биологически активные вещества в физиологических и биохимических процессах в организме животного: Учебное пособие / М.И. Клопов, В.И. Максимов. - СПб.: Лань, 2012. - 448 c.

14. Михайлов, С.С. Спортивная биохимия: Учебник для вузов и колледжей физической культуры / С.С. Михайлов. - М.: Сов. спорт, 2012. - 348 c.

15. Репников, Б.Т. Товароведение и биохимия рыбных товаров: Учебное пособие / Б.Т. Репников. - М.: Дашков и К, 2013. - 220 c.

16. Рогожин, В.В. Биохимия молока и мяса: Учебник / В.В. Рогожин. - СПб.: ГИОРД, 2012. - 456 c.

17. Рогожин, В.В. Биохимия растений: Учебник / В.В. Рогожин. - СПб.: ГИОРД, 2012. - 432 c.

18. Рогожин, В.В. Практикум по физиологии и биохимии растений: Учебное пособие / В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина. - СПб.: ГИОРД, 2013. - 352 c.

19. Таганович, А.Д. Патологическая биохимия: Монография / А.Д. Таганович. - М.: БИНОМ, 2013. - 448 c.

20. Филиппович, Ю.Б. Биохимические основы жизнедеятельности человека: Учебное пособие для студентов вузов / Ю.Б. Филиппович, А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова, Н.М. Кутузова. - М.: ВЛАДОС, 2005. - 407 c.

21. Щербаков, В.Г. Биохимия и товароведение масличного сырья / В.Г. Щербаков, В.Г. Лобанов. - М.: КолосС, 2012. - 392 c.

Другие похожие работы, которые могут вас заинтересовать.вшм>
3791.		Рыночный механизм: сущность, структура, функции	86.49 KB
	Рыночный механизм - это механизм взаимодействия продавцов и покупателей по поводу установления цен, объемов производства, его структуры и качества продукции, это механизм распределения ресурсов и доходов на основе объективных экономических законов рынка.
5233.		Сегнетоэлектрики – структура свойства и применение	2.33 MB
	Сегнетоэлектрики – диэлектрики, обладающие в определенном интервале температур спонтанной (самопроизвольной) поляризованностью, т. е. поляризованностью в отсутствие внешнего электрического поля. Свое название сегнетоэлектрики получили от названия минерала
7848.		Семейство ретровирусов. ВИЧ, его свойства, антигенная структура. Эпидемиология и патогенез ВИЧ-инфекции, методы диагностики. Проблемы лечения и специфической профилактики ВИЧ-инфекции	16.75 KB
	ВИЧ его свойства антигенная структура. Эпидемиология и патогенез ВИЧинфекции методы диагностики. Проблемы лечения и специфической профилактики ВИЧинфекции Специальность – Лечебное дело Подготовила преподаватель – Коледа В. Минск Актуализация темы: ВИЧинфекция инфекционный процесс в организме человека вызываемый вирусом иммунодефицита человека ВИЧ характеризующийся медленным течением поражением иммунной и нервной систем последующим развитием на этом фоне оппортунистических инфекций...
3755.		Действия над числами	16.02 KB
	При сложении двоичных чисел в каждом разряде в соответствии с таблицей двоичного сложения производится сложение двух цифр слагаемых или двух этих цифр и 1, если имеется перенос из соседнего младшего разряда
10885.		Следственные действия	41.97 KB
	В других случаях когда акцент делался на познавательный аспект следственными именовались лишь те действия которые служили способами исследования обстоятельств дела и установления истины. По поручению следователя представляемому в установленном в уголовнопроцессуальном законе порядке отдельные следственные действия по делу находящемуся в его производстве могут производить органы дознания или другие следователи. Как правило следственные действия производятся по инициативе следователя или лица производящего дознание.
5406.		Психологическая характеристика группового действия	16.13 KB
	ассматриваемые нами явления можно разделить на три основные группы: характеристики группы как субъекта действия, основанные на самосознании группы, характеристики морально-психологических отношений в процессе группового действия
533.		Сочетание действия вредных факторов	4.94 KB
	Установлено что токсичность ядов может усиливаться как при повышении так и при понижении температуры воздуха. Расширение сосудов кожи и слизистых повышает скорость всасывания токсических веществ через кожу и дыхательные пути Усиление токсического действия при повышенных температурах воздуха отмечено в отношении многих летучих ядов паров бензина и ртути оксидов азота и других. Причиной этого служит усиление процессов гидролиза повышение задержки ядов на поверхности слизистых оболочек изменение агрегатного состояния ядов. При повышенном...
7422.		ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ГЕЛИОГЕОФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА БИОСИСТЕМЫ	1.34 MB
	В результате выполнения дипломной работы изучена реакция волютиновых гранул на геогелиофизические воздействия. Получены графики, выражающие зависимости типа реакции метахромазии от различных гелиофизических факторов. Наблюдение 3 типа реакции метахромазии зачастую происходит спустя 2-3 суток после максимумов Ар, Кр индексов геомагнитной возмущенности. Получены данные корреляционных зависимостей по Пирсону
3643.		Принципы действия угол. закона в пространстве	2.96 KB
	Это вопрос опредия территории на которой применяется УЗ. Лицо совершившее ПРе на территории РФ подлежит угол. Граждане РФ и постоянно проживающие в РФ лица без гражданства совершившие ПРе вне пределов РФ подлежат УО по УК если совершенное ими деяние признано ПРем в госве на территории которого оно было совершено и если эти лица не были осуждены в иностранном госве. При осуждении указанных лиц наказе не может превышать верхнего предела санкции предусмотренной законом иностранного госва на территории кго было совершено ПРе.
17448.		Исследование овощеочистительной машины периодического действия МОК-250	364.1 KB
	Пища является одной из основ в жизни людей как источник энергии для жизнедеятельности организма человек должен питаться от 1 до 5 раз в день. Полноценная пища её рацион содержит все незаменимые элементы пищи это такие элементы которые пища должна включать для того чтобы обеспечить нормальное функционирование организма человека. Раздел Безопасность жизнедеятельности уделяет особое внимание технике безопасности а также всем мерам принимаемым для того чтобы работа на исследуемой машине приносила как можно меньше вреда и опасности...

До последнего времени считалось, что абсолютно все ферменты являются веществами белковой природы. Но в 80-е годы была обнаружена каталитическая активность у некоторых низкомолекулярных РНК. Эти ферменты назвалирибозимами . Остальные, свыше 2000 известных в настоящее время ферментов, имеют белковую природу и характеризуются всеми свойствами белков.

По строению ферменты делятся на:

1.простые или однокомпонентные;

2.сложные или двухкомпонентные (холоферменты).

Простые ферменты представляют собой простые белки и при гидролизе распадаются только на аминокислоты. К числу простых ферментов относятся гидролитические ферменты (пепсин, трипсин, уреаза и др.).

Сложные белки являются сложными белками и, помимо, полипептидных цепей содержат небелковый компонент (кофактор ). К сложным белкам относится большинство ферментов.Белковая часть двухкомпонентного фермента называется апоферментом. Кофакторы могут иметь различную прочность связи с апоферментом.Если кофактор прочно связан с полипептидной цепью, он называется простетической группой . Между простетической группой и апоферментом – ковалентная связь.

Если кофактор легко отделяется от апофермента и способен к самостоятельному существованию, то такой кофактор называется коферментом.

Между апоферментом и коферментом связи слабые – водородные, электростатические и др.

Химическая природа кофакторовкрайне разнообразна. Роль кофакторов в двухкомпонентных ферментах играют:

1 – большинство витаминов (Е, К, Q, С, Н, В 1 , В 2 , В 6 , В 12 и др.);

2 соединения нуклеотидной природы (НАД,НАДФ, АТФ, КоА, ФАД, ФМН), а также целый ряд др. соединений;

3 – липолевая кислота;

4 – многие двухвалентные металлы (Мg 2+ , Mn 2+ ,Ca 2+ и др.).

Активный центр ферментов.

Ферменты – высокомолекулярные вещества, молекулярный вес которых достигает нескольких млн. Молекулы субстратов, взаимодействующих с ферментами обычно имеют гораздо меньший размер. Поэтому естественно предположить, что с субстратом взаимодействует не вся молекула фермента в целом, а только какая-то ее часть – так называемый «активный центр» фермента.

Активный центр фермента – это часть его молекулы, непосредственно взаимодействующая с субстратами, участвующая в акте катализа.

Активный центр фермента формируется на уровне третичной структуры. Поэтому при денатурации, когда третичная структура нарушается, фермент теряет свою каталитическую активность!

Активный центр в свою очередь состоит из:

1.каталитического центра, который осуществляет химическое превращение субстрата;

2.субстратного центра («якорной» или контактной площадки), которая обеспечивает присоединение субстрата к ферменту, формирование фермент-субстратного комплекса.

Четкую грань между каталитическим и субстратным центром провести можно не всегда – у некоторых ферментов они совпадают или перекрываются.

Помимо активного центра, в молекуле фермента существует т.н. аллостерический центр. Это участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому определенного низкомолекулярного вещества (эффектора), изменяется третичная структура фермента. Это приводит к изменению конфигурации активного центра и, следовательно, к изменению активности фермента. Это явление аллостерической регуляции активности фермента.

Многие ферменты являются мультимерами (или олигомерами), т.е. состоят из двух и более субъединиц- протомеров (аналогично четвертичной структуре белка).

Связи между субъединицами, в основном, не ковалентные. Максимальную каталитическую активность фермент проявляет именно в виде мультимера. Диссоциация на протомеры резко снижает активность фермента.

Ферменты – мультимеры содержат обычно четкое число субъединиц (2-4), т.е. являются ди- и тетрамерами. Хотя известны гекса- и октамеры (6-8) и чрезвычайно редко встречаются тримеры и пентамеры (3-5).

Ферменты-мультимеры могут быть построены как из одинаковых, так и из разных субъединиц.

Если ферменты-мультимеры образованы из субъединиц различных типов, они могут существовать в виде нескольких изомеров. Множественные формы фермента называют изоферментами (изоэнзимами или изозимами).

Например, фермент состоит из 4 субъединиц типов А и Б. Он может образовать 5 изомеров: АААА, АААБ, ААББ, АБББ, ББББ. Эти изомерные ферменты являются изоферментами.

Изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию, обычно воздействуют на один и тот же субстрат, но отличаются по некоторым физико-химическим свойствам (молекулярной массе, аминокислотному составу, электрофоретической подвижности и др.), по локализации в органах и тканях.

Особую группу ферментов составляют т.н. мультимерные комплексы. Это системы ферментов, катализирующих последовательные стадии превращения какого-либо субстрата. Такие системы характеризуются прочностью связи и строгой пространственной организацией ферментов, обеспечивающей минимальный путь прохождения субстрата и максимальную скорость его превращения.

Примером может служить мультиферментный комплекс, осуществляющий окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Комплекс состоит из 3-х видов ферментов (М.в. = 4 500 000).

Механизм действия ферментов

Механизм действия ферментов заключается в следующем. При соединении субстрата с ферментом образуется нестойкий фермент субстратный комплекс. В нем происходит активация молекулы субстрата за счет:

1. поляризации химических связей в молекуле субстрат и перераспределение электронной плотности;

2. деформации связей, вовлекаемых в реакцию;

3. сближения и необходимой взаимной ориентации молекул субстрата (S).

Молекула субстрат фиксируется в активном центре фермента в напряженной конфигурации, в деформированном состоянии, что приводит к ослаблению прочности химических связей и снижает уровень энергетического барьера, т.е. субстрат активизируется.

В процессе ферментативной реакции различают 4 этапа:

1 – присоединение молекулы субстрата к ферменту и образование фермент-субстратного комплекса;

2 – изменение субстрата под действием фермента, делающее его доступным для химической реакции, т.е. активизация субстрата;

3 – химическая реакция;

4 – отделение продуктов реакции от фермента.

Это можно записать в виде схемы:

E + SESES* EPE + P

где: Е – фермент, S – субстрат, S* - активизированный субстрат, Р – продукт реакции.

На 1-ом этапе к субстратному центру присоединяется с помощью слабых взаимодействий та часть молекулы субстрата, которая не подвергается химическим превращениям. Для образования фермент-субстратного комплекса (ES) необходимо соблюдение трех условий, которые и определяют высокую специфичность действия фермента.

Условия образования фермент-субстратного комплекса:

1.структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента. По выражению Фишера они должны подходить друг к другу, «как ключ к замку». Это подобие обеспечивается на уровне третичной структуры фермента, т.е. пространственного расположения функциональных групп активного центра.

2.электростатическое соответствие активного центра фермента и субстрата, которое обусловлено взаимодействием противоположно заряженных групп.

3.гибкость третичной структуры фермента – «индуцированное соответствие». Согласно теории вынужденного или индуцированного соответствия каталитически активная конфигурация молекулы фермента может возникать лишь в момент присоединения субстрата в результате его деформирующего воздействия по принципу «рука-перчатка».

Механизм действия однокомпонентных и двухкомпонентных ферментов аналогичен.

В образовании фермент-субстратного комплекса у сложных ферментов принимают участие и апофермент и кофермент. При этом субстратный центр располагается обычно на апоферменте, а кофермент принимает участие непосредственно в акте химического превращения субстрата. На последнем этапе реакции апофермент и кофермент выделяются в неизменном виде.

На 2 и 3 этапе превращение молекулы субстрата связано с разрывом и замыканием ковалентных связей.

После осуществления химических реакций фермент переходит в исходное состояние и происходит отделение продуктов реакции.

Способность фермента катализировать определенный тип реакции называют специфичностью.

Специфичность бывает трех видов:

1.относительная или групповая специфичность – фермент действует на определенный вид химической связи (например, фермент пепсин расщепляет пептидную связь);

2.абсолютная специфичность - фермент действует только на один строго определенный субстрат (например, фермент уреаза расщепляет амидную связь только в мочевине);

3.стехиометрическая специфичность – фермент действует только на один из стереоизомеров (например, фермент глюкозидаза сбраживает только D-глюкозу, но не действует на L-глюкозу).

Специфичность фермента обеспечивает упорядоченность протекания реакций обмена веществ.